DNA雙鏈斷裂 (DNA double-strand break, DSB) 是一種常見且高度有害的DNA損傷形式，嚴(yán)重威脅著基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞存活。DSB修復(fù)缺陷或失調(diào)與腫瘤、衰老以及免疫缺陷等密切相關(guān)。非同源末端連接（Non-homolouous end joining, NHEJ）和同源重組（Homologous recombination, HR）是DSB修復(fù)的兩條主要通路。一般地，HR被認(rèn)為是DNA高保真的修復(fù)方式，但在特定情況下，如對(duì)于富含重復(fù)序列的異染色質(zhì)來說，HR修復(fù)則容易造成非等位基因間的同源重組（non-allelic homologous recombination, NAHR），從而導(dǎo)致染色體的重排與畸變。因此，細(xì)胞如何調(diào)控和選擇這兩種途徑對(duì)DNA修復(fù)的精確性以及基因組穩(wěn)定性的維持至關(guān)重要。DNA雙鏈斷裂末端的加工模式?jīng)Q定了NHEJ/HR修復(fù)途徑的選擇。此外，不同的染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布也影響著DSB修復(fù)，比如異染色質(zhì)核纖層關(guān)聯(lián)域（Lamina-associated domains，LADs）分布在核周（nuclear periphery），更傾向于原位的NHEJ修復(fù)。但是，如何根據(jù)不同的染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布實(shí)現(xiàn)不同的DSB末端加工和修復(fù)途徑的選擇，目前研究仍然知之甚少。

        2023年6月15日，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院松陽洲課題組與孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院合作在Nature Cell Biology雜志發(fā)表了題為Transmembrane nuclease NUMEN/ENDOD1 regulates DNA repair pathway choice at the nuclear periphery的研究成果。其中艾基生物合成生物學(xué)平臺(tái)為本課題提供siRNA合成等服務(wù)。

        PARP抑制劑（PARPi）是臨床上治療BRCA突變?nèi)橄侔┖吐殉舶┑囊痪€靶向藥物，可以通過合成致死的方式特異性殺死BRCA突變的腫瘤細(xì)胞。但是，如果腫瘤細(xì)胞中NHEJ的某些關(guān)鍵調(diào)控因子如53BP1、RIF1等發(fā)生缺失或突變，則會(huì)導(dǎo)致HR通路重新激活，從而引起對(duì)PARPi的抗藥性。利用這個(gè)特性，可以通過全基因組水平的PARPi耐藥篩選，尋找一些能調(diào)控NHEJ/HR修復(fù)通路選擇且未知的NHEJ調(diào)控因子。   NUMEN的核膜定位為核周分布的LADs進(jìn)行NHEJ修復(fù)創(chuàng)造了條件，有利于基因組穩(wěn)定性的維持。另外，NUMEN的缺失也會(huì)導(dǎo)致BRCA1突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)PARPi產(chǎn)生耐藥。NUMEN的發(fā)現(xiàn)解釋了細(xì)胞如何根據(jù)不同染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布選擇最有利的DSB修復(fù)方式，以最大程度維持基因組的穩(wěn)定性。

        研究人員首先通過全基因組的CRISPR敲除篩選，得到一系列可造成PARPi耐藥的候選基因，其中包括已知的耐藥基因如53BP1、RNF168與SLFN11等，證明了篩選結(jié)果的可靠性。其中，ENDOD1作為一個(gè)潛在的核酸酶，在篩選結(jié)果中排名靠前且在DNA損傷修復(fù)中的作用幾乎未見報(bào)道，于是研究人員重點(diǎn)選取了ENDOD1作為實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象。基于本研究中發(fā)現(xiàn)ENDOD1的一些新特征，研究人員將其重新命名為NUMEN（Nuclear membrane endo/exonuclease）。

        研究人員接著驗(yàn)證了NUMEN敲除可導(dǎo)致多種BRCA1突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)PARPi耐藥，其缺失也可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多種DNA損傷藥物更為敏感。接下來，研究人員通過體外酶切實(shí)驗(yàn)鑒定了NUMEN蛋白的酶活特性，發(fā)現(xiàn)NUMEN同時(shí)具有核酸內(nèi)切酶和3’→5’外切酶活性，能特異切割ssDNA以及3’ overhang DNA，產(chǎn)生1-4 nt 5’ overhang末端。有趣的是，在相同的反應(yīng)濃度下，NUMEN沒有顯示出對(duì)雙鏈DNA內(nèi)部和RNA底物有顯著的切割活性。NUMEN切割雙鏈DNA末端產(chǎn)生的1-4 nt 5’ overhang已被證實(shí)比3’ overhang DSB具有更高的NHEJ效率，研究人員推測(cè)NUMEN參與細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)的過程。

        進(jìn)一步，研究人員確認(rèn)NUMEN敲除可以使細(xì)胞核內(nèi)3’ overhang DNA累積增加，HR總體水平升高，NHEJ通路受到破壞；過表達(dá)NUMEN則有相反的效果。對(duì)于TRF2敲除的細(xì)胞，NUMEN失活導(dǎo)致NHEJ依賴的端粒融合比例下降。另外，NUMEN缺失也可以重新激活BRCA1敲除細(xì)胞的HR修復(fù)通路，這是BRCA1突變細(xì)胞產(chǎn)生PARPi耐藥的基礎(chǔ)。通過以上實(shí)驗(yàn)，研究人員證實(shí)了NUMEN可以促進(jìn)NHEJ并抑制HR修復(fù)，通過拮抗3’ overhang形成參與調(diào)控DNA雙鏈損傷修復(fù)途徑的選擇。

        免疫熒光結(jié)果顯示，NUMEN定位于細(xì)胞核膜。利用鄰近蛋白標(biāo)記技術(shù)（BioID），研究人員進(jìn)一步鑒定了NUMEN的相互作用蛋白組。除了與NHEJ通路的關(guān)鍵蛋白DNA-PKcs相互作用外，大量的核膜蛋白包括LAD相關(guān)蛋白也在質(zhì)譜中富集。運(yùn)用超分辨顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞追蹤發(fā)現(xiàn)，一部分細(xì)胞核內(nèi)部的DSB損傷點(diǎn)可以動(dòng)態(tài)地移到核膜與NUMEN發(fā)生互作；而核周區(qū)域產(chǎn)生的DSB也能在核膜附近進(jìn)行原位修復(fù)。那么，作為一個(gè)核酸酶，NUMEN錨定在核膜的意義是什么呢？結(jié)合LADs更傾向于在原位進(jìn)行NHEJ修復(fù)，研究人員猜測(cè)NUMEN與LADs的損傷修復(fù)相關(guān)。為此，研究人員構(gòu)建了用于追蹤LADs的m6A-Tracer系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)NUMEN與LADs存在很好的共定位。利用zeocin誘導(dǎo)DSB形成，研究人員發(fā)現(xiàn)NHEJ標(biāo)志蛋白53BP1和RIF1在核周與NUMEN的共定位比HR標(biāo)志蛋白更多，而NUMEN敲除后53BP1的核周分布則明顯減少。利用CRISPR/Cas9對(duì)分布在LADs上的LINE重復(fù)序列進(jìn)行切割，研究人員發(fā)現(xiàn)NUMEN敲除導(dǎo)致LADs上的DSB修復(fù)效率顯著變慢。

        最后，研究人員通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，NUMEN低表達(dá)的乳腺癌樣本中，與基因組瘢痕（Genomic Scar）相關(guān)的幾種特征都有所升高；而且NUMEN表達(dá)水平與多種腫瘤的基因組拷貝數(shù)變異（CNV）呈顯著負(fù)相關(guān)。這提示NUMEN對(duì)基因組穩(wěn)定性的維持起著重要的作用。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，NUMEN與BRCA1的表達(dá)水平也有著微妙的平衡關(guān)系，我們猜測(cè)NUMEN可能通過避免高重復(fù)序列的異染色質(zhì)間發(fā)生NAHR繼而對(duì)基因組起保護(hù)作用。

        綜上所述，該研究揭示了NUMEN作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的核膜錨定核酸酶，可以對(duì)DSB末端和3’ overhang DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生有利于NHEJ修復(fù)的底物，并調(diào)控NHEJ/HR通路的選擇。NUMEN的核膜定位促進(jìn)了LADs進(jìn)行NHEJ修復(fù)，有助于基因組穩(wěn)定性的維持。

NUMEN的作用機(jī)制模型

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41556-023-01165-1