廣州艾基生物技術(shù)有限公司
Guangzhou IGE Biotechnology Co., Ltd.
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技術(shù)支持
致力于引進(jìn)國外先進(jìn)技術(shù)，為廣大科研工作者和醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供高質(zhì)量 的科研技術(shù)支持 。
PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤，怎么辦？
A15:因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，會得到正確的結(jié)果。如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如進(jìn)行索賠時，按國際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價格范圍之內(nèi)。
能否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進(jìn)行定量？
A14:不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來對合成的DNA進(jìn)行定量。
合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時無目的條帶，如何解釋？
PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮:引物和模板是否配對，同源性有多大；引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)；PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作；PCR儀是否工作正常；PCR反應(yīng)條件是否合適；如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。
使用3%Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶？
對引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。
測定了引物的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280<1.8，引物純度合格嗎？
由于核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同，例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度。
一般合成的引物末端有磷酸基團(tuán)嗎？
沒有，5和3末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，則需要使用修飾合成增加磷酸化。
如何檢測引物的純度？
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結(jié)構(gòu)條帶)。
為何長鏈引物的合成費用比短鏈引物的要高？
通常在合成長鏈引物時，試劑的加入量要比短鏈引物多很多，尤其是大于90bp以上的引物，由于成本的增加，從而導(dǎo)致價格也要增加。
艾基生物可以為您合成多長的序列？
150堿基以下。
如何計算oligo的摩爾數(shù)？
1個OD值的Oligo的重量約為33 μg，而每個堿基的平均分子量一般按330道爾頓進(jìn)行計算。因此， 合成oligo的nmol數(shù)一般按以下公式粗略地計算： nmole數(shù)=(OD值x33μg)/(堿基數(shù)x330)x1000=OD值/堿基數(shù)x100如果需要計算合成DNA的精確濃度，請按以下公式進(jìn)行計算： nmole數(shù)=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]
oligo如何定量？
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進(jìn)而可以計算出母液的OD值。
oligo如何保存？
沒有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數(shù)管保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復(fù)多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液后進(jìn)行實驗。
oligo如何溶解？
我們的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。
艾基引物純化方式？
純化方式 詳細(xì)說明 C18 柱脫鹽 又稱為簡易反相柱，對DNA 有特異性吸附，可被有機(jī)溶液洗脫，但不會被水洗脫，因此能有效地去除鹽分。 R-PAGE 基于特異或反向?qū)游龇? 從合成好的產(chǎn)物中去除失敗序列，適于35 個堿基以下的引物。 PAGE 純化 PAGE 純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA 進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。 HPLC 純化 HPLC 純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA 進(jìn)行純化。該方法用于分離純化或分析時能達(dá)到很高的純度和靈敏度。常用的有離子交換HPLC 和反相HPLC。
引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。（1） 去保護(hù)：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護(hù)基團(tuán) DMT ，獲得游離的 5'- OH；（2） 耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基 5'- OH仍然被 DMT 保護(hù)，3' 端被活化與溶液中游離的 5'- OH發(fā)生耦合反應(yīng)；（3） 封閉：耦合反應(yīng)中極少數(shù) 5'- OH沒有參加反應(yīng) ，用封閉試劑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)；（4） 氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯。合成后處理：切割與脫保護(hù)基：將合成好的寡核苷酸…
怎樣處理特殊大小的細(xì)胞?
有的細(xì)胞特別大或特別小，特別是一些原代細(xì)胞，還有的細(xì)胞成團(tuán)無法計數(shù)。對于這種細(xì)胞，從預(yù)實驗開始就會有所不同。預(yù)實驗時，保持感染時細(xì)胞的匯合率達(dá)到30~40%，即使細(xì)胞沒有預(yù)定的10000 個/孔的數(shù)目，正式實驗的細(xì)胞匯合率應(yīng)盡量控制在這個數(shù)量。對于成團(tuán)的細(xì)胞，如胰島細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞等，應(yīng)注意細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和大小，以便以后的實驗按比例放大。
加入病毒后，目的細(xì)胞死亡很多，為什么?
Lentivirus可能對您的目的細(xì)胞有一定的毒性，請調(diào)整并降低感染的MOI值，并且在感染4 h、8 h、12 h后對細(xì)胞進(jìn)行換液，用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察。
目的細(xì)胞可以被Lentivirus感染，但是GFP熒光強(qiáng)度很低，為什么?
目的細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度取決于病毒感染細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)、細(xì)胞類型以及觀察時間等。一般來講，目的細(xì)胞感染病毒顆粒數(shù)越多，細(xì)胞本身增殖越快，GFP熒光會較強(qiáng)。Lentivirus屬于慢病毒，一般在增殖較快的細(xì)胞中病毒感染48~72h后，GFP基因表達(dá)才達(dá)到高峰。對于增殖較慢的細(xì)胞，GFP基因表達(dá)時間還會延長。
Lentivirus對目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率?
一般我們通過提高M(jìn)OI值來提高病毒的轉(zhuǎn)染效率，必要時可在培養(yǎng)液中加入Polybrene (4~10 μg/mL)來提高病毒的感染率。同時，目的細(xì)胞良好的生長狀態(tài)是獲得正常感染效率的保證。
常見細(xì)胞推薦的MOI
常見細(xì)胞推薦的MOI
Lentivirus在細(xì)胞水平的使用
艾基提供的Lentiviral Vector Particle為VSVG膜蛋白包裹的，雖然與其他的膜蛋白相比，它能夠感染的細(xì)胞種類大大增加，但是對不同的細(xì)胞和組織的感染性仍有差別。在使用Lentivirus之前請查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解這種Lentivirus對目的細(xì)胞的親嗜性，復(fù)感染指數(shù)（MOI值）以及在體內(nèi)（in vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，則需要檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性。實際上即使有文獻(xiàn)支持，但因為不同實驗的細(xì)胞代數(shù)，個體差異，細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)系，細(xì)胞實際的MOI和文獻(xiàn)報道的往往會有差異。因此，正式實驗前一般會安排預(yù)實驗，以了解細(xì)胞所需MOI以及病毒對細(xì)胞狀態(tài)和傳代的影響。1. 目的細(xì)胞感染預(yù)實驗 說明：MOI值：感染復(fù)數(shù)或…
Lentivirus使用安全注意事項
艾基提供的慢病毒載體屬于“第二代”慢病毒載體，其基因組的3’ LTR的增強(qiáng)子功能發(fā)生了缺失，從而形成了所謂的“自滅活”（Self-inactivation，SIN），即該病毒基因組整合到細(xì)胞基因組后，不會產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活，因此具有較好的安全性。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險，所以建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實驗，如有疑問，請與我們聯(lián)系。使用時請參照如下所示進(jìn)行實驗：1. 病毒操作時請使用生物安全柜（BSL-2）。2. 病毒操作時請穿實驗服，戴口罩和手套。3. 操作病毒時應(yīng)小心，避免…
Lentivirus的儲存與稀釋
1. 收到病毒液后4℃保存(請于一周內(nèi)用完)，如需長期保存則存放于-80℃。避免反復(fù)凍融，否則會降低病毒滴度，一般病毒可以存放于-80℃約6個月。6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。2. 艾基提供的Lentivirus溶于HBSS中 (pH7.4) 。病毒使用時，請將病毒從-80℃冰箱取出，冰浴融化，4℃存放。如有需要稀釋病毒，則可加入適量的HBSS混勻使用，也可以用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。3. “TU/mL”：Transducing Units，轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，表示可以感染并進(jìn)入到目標(biāo)細(xì)胞群中的病毒基因組數(shù)。艾基提供的慢病毒單位標(biāo)識為TU/mL時，即每毫升慢病毒溶液中含有具有生物活性的慢病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度>1×10∧8 TU/mL，即每毫升病毒液中至少含有1×10∧8個具有…
全基因組de novo測序常見問題
如何保證組裝結(jié)果的可靠性？對于組裝的結(jié)果，除了保證Contig N50和Scaffold N50兩項指標(biāo)外，還需要對組裝質(zhì)量進(jìn)行評估。如利用EST數(shù)據(jù)和RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行完整性評估，即評估組裝出來的基因的完整性；利用BAC數(shù)據(jù)檢驗是否有裝斷或裝錯的情況，以及利用保守基因評估（CEGAM評估／BUSCO評估）基因組組裝的完整性。 小片段和大片段的DNA樣品是否需要是一樣的？（Survey和基因組 de novo 所用DNA是否需要一樣的？）原則上進(jìn)行 Survey 和 de novo 使用的 DNA 是來自一個個體的。如果DNA量不足以滿足整個de novo項目，則建議小片段文庫的DNA必須來自同一個體，大片段文庫使用同一群體的另一個個體。 若樣品提取困難，樣品量不足，有什么辦法…
全基因組甲基化測序常見問題
哪些物種可以研究WGBS?要做全基因組甲基化分析，對物種有以下要求：a. 物種為真核生物；b. 物種具有參考基因組，至少拼接到scaffold水平；c. 具有較為完整的注釋。 全基因組甲基化測序有哪些優(yōu)勢？在全基因組水平，單堿基分辨率檢出甲基化位點，不僅能夠高精度發(fā)現(xiàn)CpG島等常見區(qū)域的甲基化水平的變化，還能夠分析gene body區(qū)，基因間區(qū)等區(qū)域的甲基化水平的差異，分析甲基化對染色體的狀態(tài)以及基因結(jié)構(gòu)變化的影響，從多維度分析解決生物學(xué)問題。
small RNA測序常見問題
沒有參考基因組的物種，可以做small RNA測序嗎？無參考基因組的物種可以開展small RNA測序研究，但是需要先做無參轉(zhuǎn)錄組拼接轉(zhuǎn)錄本，以轉(zhuǎn)錄本作為參考序列用于small RNA測序分析。 已知miRNA分析中，樣品的首位及各位堿基的偏好性統(tǒng)計圖可以說明什么？miRNA前體發(fā)育為成熟體的過程是由Dicer酶酶切完成，酶切位點的特異性使得miRNA成熟體序列首位堿基對U具有很強(qiáng)的偏向性,而對G卻排斥，但第二到四位缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置通常都缺乏C。 sRNA測序完成后如何進(jìn)行實驗驗證?sRNA后續(xù)實驗驗證的方法有很多：1. qPCR，驗證microRNA的表達(dá)；2. RIP-seq，通過RIP技術(shù)富集得到具有甲基化修飾的RNA或與目的蛋白特異結(jié)合…
circRNA測序常見問題
用芯片技術(shù)和用二代測序技術(shù)分析circRNA有什么區(qū)別？芯片技術(shù)只能檢測已知的circRNA，而且噪音信號比較大，現(xiàn)在對circRNA的研究相對較少，對circRNA的注釋不全面；另外，circRNA的表達(dá)具有很強(qiáng)的時空特異性，我們又難以保證實驗處理條件下獲得的數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中收錄的數(shù)據(jù)吻合，因此可能丟失大量特異表達(dá)的circRNA；二代測序技術(shù)使用先進(jìn)軟件對樣本中circRNA進(jìn)行篩選，不僅能分析已知的circRNA，更能獲得新的circRNA，進(jìn)一步豐富對circRNA的研究。 circRNA與lncRNA的差別是什么？結(jié)構(gòu)上：circRNA沒有自由的5’端和3’端功能上： circRNA功能研究比較單一，現(xiàn)在對于其是否能夠像lncRNA一樣在染色體水平、蛋白 質(zhì)水平上具有調(diào)控作用…
lncRNA測序常見問題
哪些物種可以研究lncRNA？要做lncRNA分析，對物種有以下要求：a. 物種為真核生物；b. 物種具有參考基因組，至少拼接到scaffold水平；c. 具有較為完整的注釋。 lncRNA測序，構(gòu)建文庫時為什么要去除rRNA？lncRNA中只有l(wèi)incRNA的3’端帶有polyA結(jié)構(gòu)，其他lncRNA沒有polyA結(jié)構(gòu)，因此，為了獲得更全的lncRNA信息，不建議采用oligo(dT)磁珠富集的方式。 lncRNA靶基因預(yù)測是怎么實現(xiàn)的？lncRNA作為調(diào)控性RNA，調(diào)控靶基因的方式主要有co-location與co-expression。co-location靶基因預(yù)測基本原理認(rèn)為lncRNA的功能與其坐標(biāo)臨近的蛋白編碼基因相關(guān),于是將lncRNA臨近位置的（上下游100K）蛋白編碼基因篩出來作為其靶基因。co-expression靶基…
16S、18S、ITS等擴(kuò)增子測序常見問題
擴(kuò)增子測序諾禾用Ion S5 XL平臺，該平臺有什么優(yōu)勢？Ion S5 XL所采用的技術(shù)為半導(dǎo)體測序，通過半導(dǎo)體芯片直接將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。該系統(tǒng)無激光光源，無光學(xué)系統(tǒng)，無照相系統(tǒng)；使用無標(biāo)記的核苷酸及酶進(jìn)行測序通過對H+ 的檢測，明顯改善堿基判讀準(zhǔn)確性。相比Illumina HiSeq PE250，該平臺讀長更長，無需拼接，周期更短。 16S測序哪個區(qū)域比較合適？艾基生物提供的幾個測序區(qū)域來自文獻(xiàn)調(diào)研，但是目前并沒有研究表明哪個測序區(qū)域更好。有文章研究表明土壤樣本，16S V4區(qū)（515F-806R）比較適合做擴(kuò)增子研究，可檢測的物種多樣性更豐富，并且可重復(fù)性強(qiáng)（PNAS. 2013. 110(16): 6548-6553.）。 若關(guān)注環(huán)境中的真核微生物多…
微生物重測序常見問題
重測序與基于基因組的變異檢測有何差異？基于基因組的研究，可以比重測序獲得更多變異信息，特別是基因組中高變異的區(qū)域，以及部分新基因信息。此外，對于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株，由于高變區(qū)域較多，借助基因組手段效果會更理想。而重測序的優(yōu)勢主要在于成本方面。對于大量近緣菌株間的進(jìn)化研究，用重測序結(jié)果作為研究基礎(chǔ)是足夠的，可以用同樣的費用獲得更多材料的變異信息。 基于重測序和基于單拷貝基因的進(jìn)化分析有何差異？進(jìn)化分析的基本要求，是找到不同基因組之間共有的保守序列，并通過序列間的差異，使用合適的數(shù)學(xué)模型構(gòu)建菌株間的進(jìn)化關(guān)系，通過重測序和單拷貝基因都能達(dá)到這樣的目的。由于采用的數(shù)據(jù)集合有所差異，因此個…
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